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Forschung im AK Dr. W. Hüttel

 

α-Ketosäureabhängige Enzyme als Katalysatoren für selektive Oxidationen

Eine besondere Herausforderung in der chemischen Synthese ist die gezielte Einführung funktioneller Gruppen an vergleichsweise unreaktiven Kohlenwasserstoffketten von Molekülen. Die klassisch-chemischen Methoden für diesen Reaktionstyp, der auch als "CH-Aktivierung" bezeichnet wird, sind noch sehr eingeschränkt. Dagegen werden CH-Aktivierungen in der Biosynthese von Naturstoffen häufig beobachtet. Die Erschießung der zugehörigen Biokatalysatoren für Wirkstoffsynthesen ist allerdings durch die hohe Empfindlichkeit und die schwierige Handhabung dieser oxidierenden Enzyme erschwert. 

Eine synthetisch bisher kaum beachtete Gruppe CH-aktivierender Enzyme sind die Nicht-Häm-Fe(II)-Oxygenasen. In unserer Gruppe werden α-Ketoglutarat-abhängige Prolin¬hydroxylasen und Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenasen (HPPDs) aus dem Tyrosin-Abbauweg sowie dazu verwandte Enzyme bearbeitet. Ein Ziel ist es, durch Kombination verschiedener Substrate mit Enzymen unterschiedlicher Selektivität ein breites Spektrum neuer chiraler Synthesebausteine im präparativen Maßstab zugänglich zu machen. Daneben soll in Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen über strukturbiologische und mechanistische Ansätze versucht werden, die Ursachen für die unterschiedlichen Regio- und Stereoselektivitäten der einzelnen Enzyme zu verstehen. Damit sollte es auch möglich werden, die katalytischen Eigenschaften der Enzyme durch Mutagenese gezielt zu verändern, beziehungsweise für bestimmte Substrate zu optimieren.

 

 

Nicht-Häm-Fe(II)-Oxygenasen bilden eine größere Gruppe von Enzymen, die Substrate mit molekularem Sauerstoff oxidieren. Dabei werden in der Regel  Hydroxygruppen (-OH) eingeführt, aber es kann auch zur Bildung von Doppelbindungen oder  Umlagerungen kommen. Neben dem eigentlichen Substrat werden noch Sauerstoff und α-Ketoglutarat (αKG) zu Katalyse benötigt, wobei aus letzterem CO2 oxidativ abgespalten wird. Im aktiven Zentrum des Enzyms ist ein Eisen(II)-ion koordiniert, dass mit Sauerstoff im Verlauf der Katalyse einen hochreaktiven Eisen(IV)oxo-komplex bildet, der das Substrat angreift. Bemerkenswert ist dabei, dass trotz dieses aggressiven Eisen(IV)-Komplexes die Reaktion am Substrat kontrolliert abläuft und nur ein Produkt  regio- und stereoselektiv gebildet wird. Deshalb und wegen des günstigen Cosubstrats (αKG) stellen diese Enzyme in der Biokatalyse eine interessante Alternative zu den Cytochrom P450 Oxygenasen dar.

 
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Abbildung 1: Katalytische Oxidation mit einer α-Ketoglutarat-abhängigen Oxygenase.

 
Derzeit werden zwei enzymatische Systeme untersucht:

 

1. Prolinhydroxylasen
 

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Abbildung 2: Prolinhydroxylasen mit unterschiedlicher Regio- und Stereoselekivität. cis-P3H: cis-3-Prolinhydroxylase; cis-P4H: cis-4-Prolinhydroxylase; trans-P3H: trans-3-Prolin¬hydroxylase; trans-P4H: trans-4-Prolinhydroxylase.

  

Prolinhydroxylasen oxidieren freies L-Prolin mit hoher Regio- und Stereoselektivität. Für alle der vier möglichen Hydroxyprolinisomere sind enzymatische Aktivitäten bekannt, eine trans-P3H wurde aber bisher nicht in reiner Form isoliert. Die trans-P4H und die cis-P3H werden auch technisch zur Produktion von Hydroxyprolinen eingesetzt. Auch die erst vor kurzem entdeckte cis-P4H dürfte dafür geeignet sein. Es zeigte sich außerdem, dass Prolin¬hydroxylasen trotz der hohen Selektivität während der Reaktion eine Reihe von anderen Substraten akzeptieren, so dass durch Variation von Enzym und Substrat eine bemerkenswerte Diversität von chiralen chemischen Bausteinen zugänglich ist. Für unseren Forschungsansatz können drei Ebenen unterschieden werden.

Substrattestung. Durch Umsetzung verschiedener nicht-physiosogischer Verbindungen wird zunächst das Substratspektrum des jeweiligen Enzyms getestet. Die Erzeugung von Produkten im Milligrammmaßstab ist mit isolierten Enzymen (in vitro) gut möglich, so dass auch die Analytik gut durchführbar ist. Eine Produktion in größerem Maßstab ist wegen der niedrigen Aktivität und der Empfindlichkeit der Enzyme unter Katalysebedingungen nicht sinnvoll. Um trotzdem Produkte im präparativen Maßstab erhalten zu können, haben wir ein einfaches in vivo-Verfahren entwickelt, bei dem das Substrat mit vitalen E. coli Zellen, die das jeweilige Enzym produzieren, umgesetzt wird. Auf diese Weise können in Schüttelkulturen Hydroxyproline mit >1 g/L und Hydroxylierungsprodukte nicht-natürlicher Substrate mit >0.5 g/L herstgestellt werden.

Darüber hinaus möchten wir die Ursachen für die hohe Selektivität bei der Katalyse aufklären. Dieser Frage soll in einem interdisziplinären Ansatz mit Kooperationspartnern auf struktureller (Kristallstrukturanalyse, Modeling), mechanistischer (EPR und andere Spektroskopie) und biokatalytischer Ebene (Mutagenese, Enzymtestung) nachgegangen werden. Fernziel ist es die Substrattoleranz und die Selektivität der Enzyme gezielt zu verändern, so dass weitere, synthetisch besonders interessante Bausteine zugänglich werden. Ein solcher Ansatz könnte dann auch auf andere synthetisch interessante Enzyme aus dieser Gruppe übertragen werden.

 

Teile dieses Projekts werden durch die Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU) Verbundprojekt AZ 13234-32 "Nachhaltige Biokatalytische Oxidationsprozesse" unterstützt.

 

2. Hydroxphenylpyruvatdioxygenase (HPPD) und verwandte Enzyme

 

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 Abbildung 3: Die unterschiedlichen Regioselektivitäten bei der Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) und Varianten sowie der Hydroxymandelat-Synthase (HMAS) führen zu grundverschiedenen Produkten.

 

 

Die Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) katalysiert einen zentralen Schritt beim Abbau der Aminosäure Tyrosin und kommt daher in allen höheren Organismen und vielen Bakterien vor. Der Reaktionsmechanismus ist komplex und umfasst eine oxidative Decarboxylierung, eine Umlagerung der Seitenkette des Aromaten sowie eine Hydroxylierung des aromatischen Kerns. Da die CO2-Abspaltung am Substrat erfolgt, ist die HPPD nicht α-KG abhängig. Auch die Proteinstruktur ist anders als bei den αKG-abhängigen Enzymen. Der Katalysemechanismus ist aber nahezu identisch.

Die Hydroxymadelat-Synthase (HMAS) wird bei einigen Bakterien zur Biosynthese von Antibiotika (Vancomycin, Sporolid A) benötigt. Sie ist mit der HPPD strukturell sehr eng verwandt und setzt auch dasselbe Substrat um. Allerdings wird HPP hier an der CH2-Einheit und nicht am Aromaten oxidiert, so dass Hydroxymandelsäure entsteht. Versuche durch Mutagenese HPPD in HMAS umzuwandeln waren in sofern erfolgreich, als Mutanten erzeugt wurden, die neben Homogentisinsäure (HGA) auch Hydroxymandelsäure (HMA) und eine ungewöhnliche Oxepinonstruktur produzierten. HPPD und HMAS sind ein ideales Beispiel dafür, dass schon geringfügige Änderungen in der Nähe des aktiven Zentrums eines Enzyms chemisch grundverschiedene Produkte hervorbringen können. Dies zeigt wie Evolution auf biosynthetischer Ebene ablaufen kann.   

 

Methoden:

Enzymkatalyse in vitro und in vivo; chemische Analytik, v.a. HPLC, NMR; präparative chromatographische Methoden, PCR, Mutagenesetechniken, Klonierung (E. coli), Proteinexpression und Reinigung

 

Gruppe:

Dr. Wolfgang Hüttel     Gruppenleiter

Dr. Loubna Youssar Postdoc, 

                                        Prolinhydroxylasen und Biosynthese von Echinocandinen in Pilzen

                                        Förderung über Humboldt Stipendium

 

Eduard Frick                Doktorand

                                       HPPD und verwandte Enzyme

Dr. Christian Klein     Postdoc, 

                                      Prolinhydroxylasen

                                      Förderung über DBU-Verbundprojekt AZ 13234-32

Olga Fuchs               Laborantin

 

Publikationen:

1.  L. Youssar, Björn A. Grüning, Annika Erxleben, Stefan Günther, Wolfgang Hüttel,

Genome Announcement: Genome Sequence of the Fungus Glarea lozoyensis: the First Genome Sequence of a Species from the Helotiaceae Family

Eukaryotic Cell 2012, 11(2), 250.

 

2. Christian Klein und Wolfgang Hüttel

Tertiary alcohol preferred: Hydroxylation of trans-3-methyl-L-proline with proline hydroxylases. 

Beilstein J. Org. Chem2011, 7, 1643-1647.

 

3. Christian Klein und Wolfgang Hüttel,

A Simple Procedure for Selective Hydroxylation of L-Proline and L -Pipecolic Acid with Recombinantly Expressed Proline Hydroxylases

Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 1375 – 1383.

 

 

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